Molekulaardiagnostika: PCR reaalajas

Praegu on molekulaarse diagnostika abil välja töötatud polümeraasi ahelreaktsiooni mehhanism (PCR), mis on muutunud hoogu geneetilise materjali määratlusele tugineva hulga haiguste diagnostiliste meetodite väljatöötamisele . Reaalajalise PCRi läbiviimiseks kasutatakse haiguse põhjustatava agensi geeni fragmenti (eriti nukleiinhapet) , mida teistes indiviidides ei leidu.

PCR-i põhimõte on patogeeni DNA teatud fragmendi kordamine DNA polümeraasi abil spetsiaalses aparaadis, mida nimetatakse termotsüklendiks ja mis tagab kindla programmi jaoks temperatuuri režiimi tsüklilise kordumise.

PCR-i diagnoosimine võimaldab korrata amplifikatsioonide rida, säilitades ensüümi aktiivsuse. Kui amplifikatsioon on takistusteta, siis ühe tsükli jooksul patogeeni DNA teatud piirkonna koopiate arv kahekordistab pärast kolmekümne tsüklit - sada sada korda. Sellepärast kasutatakse diagnostikale PCR-i, et tuvastada piisavalt väikseid patogeene, mille avastamine pole selle võimatu.

Tuleb märkida, et RNA ei saa olla reaalajaline PCR maatriks. Seetõttu on viiruse RNA tuvastamiseks vaja enne amplifikatsiooni saada DNA-d, mis vastab selle fragmendile. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab patogeeni DNA-d ja RNA-d mõõta. Sel viisil saadud teavet kasutatakse ravitava efektiivsuse jälgimiseks, samuti kliinilise prognoosi hindamiseks.

Lisaks sellele ei vaja reaalajaline PCR-i täiendavaid toiminguid uuritava DNA või amplikonite de fi tree rimiseks, mis takistavad õiget diagnoosi ja põhjustavad valesid tulemusi. Selline lähenemine võimaldab meil mitte kasutada elektroforeesi etappi, mis viib polümeraasi ahelreaktsiooniproduktide nakatumise riski vähenemiseni. Ka patogeeni manipuleerimise arvu vähenemisega vähendatakse uuringu aega, protsessi lihtsustatakse ja vigu tõenäosus väheneb. Samuti võimaldab PCR määrata patogeeni DNA koopiate esialgse arvu kliinilises uuringus, mis aitab tuvastada haiguste ägenemise aegu ja võtta õigeaegseid meetmeid patsiendi ravimiseks.

Praeguseks on võimenduse fikseerimise reaalajas palju viise. Kõige sagedamini kasutatakse erinevaid meetodeid, mis kasutavad radiokeemilisi korrelatsiooniga sonde, mille kiirguse intensiivsus varieerub amplikoni akumuleerumisega ja registreeritakse reaalajas spetsiaalse seadmega, mida nimetatakse optilise mooduli võimendiks. See tagab analüüsi tundlikkuse kõrge taseme. Sellisel juhul saab PCR-produkti tuvastada koos suure hulga kõrvalproduktidega ajal, mil elektroforeesi kasutamisel seda sageli ei märka.

PCR-ga kasutatakse positiivseid, kontroll- ja negatiivseid proove reaalajas. Seega uuritakse uuringu ajal positiivseid ja negatiivseid proove eraldi proovidena, seejärel lisatakse igasse sellesse proovi kontrollproov ja läbib kõiki analüüsimise etappe.

Praeguseks on polümeraasi ahelreaktsiooni jaoks palju seadmeid . Nende hulka kuuluvad Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid või Roche. Igaühel neist on väärtused ja puudused

Tuleb märkida, et PCR on diagnostika meetod, mida kasutatakse suurtes teadus-, uurimis- ja diagnostikakeskustes kogu maailmas, kuna see võimaldab tulemuste kiiret tõlgendamist.